扁桃AcDHN1基因的克隆及原核表达分析

【目的】 克隆与分析扁桃脱水素基因,为研究脱水素基因在扁桃抗逆机制中发挥的功能提供参考。【方法】 以新疆栽培的扁桃品种‘纸皮’叶片为材料,通过PCR技术克隆扁桃AcDHN1基因并对该基因进行原核表达分析,构建原核表达载体,在大肠杆菌进行表达。【结果】 克隆得到了一个脱水素基因,命名为AcDHN1,GenBank登陆号为KT949395,该基因全长924 bp、编码308个氨基酸的多肽,为稳定的亲水性蛋白,属于Y₂K_n型脱水素,推测蛋白分子质量为32.4 kD,亚细胞定位于细胞核中。将该基因与原核表达载体连接构建重组质粒pET-AcDHN1,然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。SDS-PAGE电泳结果表明,该蛋白分子量的大小约为52.7 kD,与预期长度一致。【结论】 对重组蛋白的诱导条件进行优化后结果显示,该基因在IPTG浓度0.1 mmol/L、诱导3 h表达量最佳。     

东北棕壤长期不同施肥处理轮作大豆氮素吸收和土壤硝态氮特征

【目的】在玉米–玉米–大豆轮作体系下,基于棕壤肥料长期定位试验,研究不同施肥处理对东北地区大豆生物量、产量、各部位吸氮量及收获期土壤0―100 cm硝态氮累积的影响,为该地区合理施肥提供理论依据和科学指导。【方法】棕壤肥料长期定位田间试验始于1979年,包括不施肥(CK)、单施氮肥(N)、氮磷钾肥配施(NPK)、低量厩肥(M1)及其与化肥配施(M1N和M1NPK)、高量厩肥(M2)及其与化肥配施(M2N和M2NPK)9个处理。厩肥为猪厩肥,1992年后大豆季不施猪厩肥,仅在玉米季相关处理中施用。39年后,调查分析了大豆生物量、产量、氮素吸收利用及大豆收获期0―100 cm土壤硝态氮累积特征。【结果】高量、低量厩肥配施化肥处理大豆生物量、产量、总吸氮量及各部位吸氮量均显著高于单施氮肥和不施肥处理,其中,M1NPK处理大豆生物量、产量和总吸氮量最高,分别为9107、2979和314.2 k g/h m^2,较其他处理分别提高了6.1%~133.6%、23.9%~232.5%和11.7%~359.4%。施肥提高了大豆氮收获指数,但氮素生理效率降低。NPK和M1NPK处理的氮素收获指数最高,均为63.5%,而氮素生理效率较CK分别降低了30.6%和28.1%。大豆收获期各处理土壤硝态氮累积量随土层深度的增加而降低。与播前相比,大豆收获期单施氮肥处理的0―100 cm土层硝态氮积累量显著增加,NPK处理变化不显著,M1、M1N和M1NPK处理显著降低。低量厩肥配施化肥处理收获期0―100 cm土壤硝态氮积累量远低于高量厩肥配施化肥处理,较播前平均降低了79.2%。所有处理中,土壤硝态氮积累量以M1NPK处理最低,比其他处理平均降低了58.2%。【结论】在东北棕壤地区玉米–玉米–大豆轮作体系下,玉米季低量厩肥(13.5 t/hm^2)与氮磷钾化肥配合施用时,大豆季仅施氮磷钾化肥既可提高大豆生物量、产量,促进氮素吸收,同时还可降低大豆收获期土壤硝态氮累积量,降低环境风险,是该轮作体系较为合理的施肥方式。     

拟南芥乙烯应答基因HLS1的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备乙烯应答基因HLS1多克隆抗体,在过表达植物中检测HLS1的积累,为深入研究HLS1响应乙烯信号通路的分子机制奠定基础。【方法】构建pET28a-HLS1c原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得重组蛋白HLS1c-His;镍柱亲和纯化重组蛋白后免疫家兔获得抗HLS1血清,利用抗原亲和纯化抗血清获得高纯度的HLS1多克隆抗体;用HLS1抗体和GFP抗体,检测原生质体瞬时转化体系中GFP-HLS1c融合蛋白的表达;用农杆菌蘸花法获得过表达GFP-HLS1g的转基因植物,用HLS1抗体和GFP抗体检测GFP-HLS1g融合蛋白的表达。【结果】成功构建了原核表达载体pET28a-HLS1c,并在大肠杆菌系统中诱导获得重组蛋白HLS1c-His,且多以包涵体形式存在。纯化的HLS1c-His多克隆抗体,能清晰检测到约80 ng原核表达的HLS1抗原。纯化的HLS1抗体不仅能检测到原生质体中瞬时表达的GFP-HLS1c融合蛋白,也能检测到过表达转基因植物株系中的GFP-HLS1g融合蛋白,并且与标签蛋白GFP对应抗体所检测到的特异性条带大小一致。【结论】成功制备了拟南芥HLS1蛋白多克隆抗体,为HLS1蛋白在植物发育中的功能研究奠定了基础。     

喀斯特地区贫困乡村景观格局及生态风险分析

为揭示喀斯特不同地貌乡村景观格局及生态风险的差异，以贵州省石门乡（喀斯特中山）、宗地镇（峰丛洼地）、周覃镇（低山丘陵）、掌布镇（峰丛峡谷）4种典型喀斯特地貌的贫困乡村为例，利用ArcGIS 10.1、Fragstats 4.2软件对乡村景观格局进行分析，并定量评价景观生态风险。结果表明，不同地貌乡镇的各斑块面积占比（PLAND）、斑块数量（NP）、斑块密度（PD）、斑块形状指数（LSI）存在较大差异。掌布镇景观水平上指标特征与石门乡相反，而宗地镇和周覃镇景观水平上指标特征介于掌布镇和石门乡之间。周覃镇与掌布镇景观生态风险低于石门乡以及宗地镇。石门乡中北部景观生态风险高于东部和西南部，与中北部以未利用地和建设用地景观为主、东部和西南部以灌草丛和林地景观为主有关。宗地镇中部比重较大的未利用地使其景观生态风险较高，而东部和西部比重较大的灌草丛使其景观生态风险较低。除西部地区外，周覃镇大部分地区耕地、林地和灌草丛的连片分布使得景观生态风险较低。中北部占主导地位的林地以及南部各地类的镶嵌分布，使掌布镇中北部景观生态风险明显低于南部。研究结果可为喀斯特地区乡村土地利用调控及生态风险管理提供科学依据。     

银杏ERF转录因子家族的全基因组学鉴定及表达模式分析

以银杏基因组数据库为基础，通过序列比对，并经过鉴定筛选，共获得112个ERF转录因子家族成员，对其进行生物信息学及表达模式分析。结果显示：银杏112个ERF成员在系统进化树上分为10个亚家族；基因结构分析表明，大部分ERF家族基因结构简单，仅少量基因含有1～4个内含子；基因表达分析显示，39个ERF基因在雄蕊中表达量较高，20个基因在幼苗中表达量较高，40个基因在胚中表达量较高；部分基因在雄蕊、胚和幼苗中具有相同的表达模式，说明其可能具有类似的功能。     

长期继代培养的转基因苹果外源基因遗传及表达稳定性分析

为研究长期继代培养的转基因苹果组培苗中外源基因的遗传及表达稳定性，以继代培养9年的7个转GFP(绿色荧光蛋白)基因苹果株系组培苗为试材，分析转基因株系对Kan(卡那霉素)的抗性、DNA水平、转录水平和转录后水平GFP基因的遗传及表达稳定性。结果表明，在7个苹果转基因株系组培苗中均可检测出GFP特异基因片段，并且均可在含有50 mg/L卡那霉素的培养基上正常生长；绝对定量qRT-PCR检测发现，各转化株系GFP基因拷贝数并不相同；利用相对定量qRT-PCR法检测发现7个株系中GFP基因 mRNA表达量有明显差异，同时荧光显微镜下观察各转化株系叶片，绿色荧光强度有明显差异，利用SPSS软件对7个转基因株系中GFP基因拷贝数与GFP mRNA表达量相关性分析结果呈无显著相关性。以上结果表明，外源基因可以在长期继代培养的转基因苹果组培苗中保持其遗传稳定性，但不同转化株系中外源基因的表达量有显著差异，其表达量与拷贝数无显著相关，可能与外源基因在植物基因组中的插入位点有关。     

捻转血矛线虫GST耐药基因的克隆、表达及生物信息学分析

为探究捻转血矛线虫GST基因的原核表达及其生物信息学特征,以捻转血矛线虫cDNA为模板,设计特异性引物扩增GST基因,构建原核表达载体pET30a(+)-GST转化至E.coil BL21(DE3)感受态细胞,将鉴定正确的重组菌进行表达条件优化后,再通过SDS-PAGE分析蛋白表达的特征,并利用在线软件对GST蛋白进行生物信息学分析。结果表明:捻转血矛线虫GST基因大小为618 bp;诱导后的pET30a(+)-GST重组菌最佳诱导条件为0.05 mmol/L的IPTG在37℃时诱导6 h,以包涵体的形式存在,大小约为29 ku。生物信息学分析表明:GST分子式为C_(1083)H_(1657)N_(277)O_(294)S_6,属于不含信号肽和跨膜区的亲水性蛋白;二级结构主要由α螺旋形成;潜在的抗原表位主要位于25～48、55～63、92～106、113～124、139～147、170～189和195～205位氨基酸附近。本试验成功构建GST基因原核表达系统,优化表达条件下能稳定纯化GST重组蛋白,为进一步探索捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药机制及GST蛋白的生物学特性提供研究基础。     

Effect of melatonin on visceral fat deposition,lipid metabolism and hepatic lipo-metabolic gene expression in male rats

Melatonin (MT) influences lipid metabolism in animals; however, the mechanistic effect of melatonin on liver fat and abdominal adipose deposition requires further clarity. In order to study the effects of melatonin on lipid metabolism, and hepatic fat and abdominal adipose deposition in animals, twenty Sprague–Dawley (SD) rats of 6 weeks of age with similar bodyweight were randomly divided into two groups: control (CTL) and MT-treated (10 mg/kg/day). During a 60-day experiment, food intake and bodyweight were measured daily and weekly respectively. At the end of treatment, blood samples were collected to collect plasma to quantify hormones and metabolic indicators of lipid metabolism. In addition, organ and abdominal adipose depots including liver, and omental, perirenal, and epididymal fat were weighed. Liver tissue was sampled for sectioning, long-chain fatty acid (LCFA) quantification, and gene chip and Real-time quantitative PCR (qPCR) analyses. The results showed that liver weight and index (ratio of liver weight to body weight) in MT group reduced by 20.69% and 9.63% respectively; omentum weight and index reduced by 59.88% and 54.93% respectively, and epididymal fat weight reduced by 45.34% (p = 0.049), relative to CTL. Plasma lipid indices, triglyceride (TG), high-density lipoprotein (HDL), low-density lipoprotein (LDL) and total cholesterol (TC) with MT treatment decreased significantly compared with the control. Fat and 8 LCFA content in liver in MT group also decreased. Gene chip and qPCR demonstrated that there were 289 genes up-regulated and 293 genes down-regulated by MT. Further analysis found that the mRNA expression of lipolysis-related genes increased, while the mRNA expression of lipogenesis-related enzymes decreased (p < 0.05) with MT. This study concluded that melatonin greatly affected fat deposition, and hepatic LCFA supply and the expression of genes associated with lipogenesis and lipolysis.     

中国农耕区土壤有机质含量及其与酸碱度和容重关系

对我国农耕区土壤有机质区域变化及其与酸碱度和容重关系进行系统分析，为耕地地力提升和改善土壤结构提供支撑。基于国家级耕地长期定位监测点913个，统计分析全国及7大区域（东北NE、华北NC、西北NW、长江中游MYR、长三角YRD、华南SC、西南SW）耕层土壤有机质含量、酸碱度及容重变化特征。结果表明，全国农耕区耕层土壤有机质含量平均值为22.4~24.8 g/kg。其中有机质含量中等偏低的监测点位占比达72.5%。不同区域耕层土壤有机质含量差异显著（p<0.05），MYR耕层土壤有机质含量显著高于其他6个区域。全国农耕区耕层土壤pH和容重平均分别为（6.90±1.20），（1.30±0.15） g/cm³。不同土壤利用方式对土壤有机质、酸碱度及容重产生影响。水田耕层土壤有机质含量显著高于旱地，旱地耕层土壤pH和容重则显著高于水田。亚当斯方程和指数函数分别推荐拟合土壤容重对有机质含量响应关系（R²=0.09，RMSE=0.17，n=759），以及土壤pH对土壤有机质含量响应（R²=0.16，RMSE=1.24，n=886）。全国农耕区耕层土壤有机质含量总体中等偏低，呈现出东南向西北依次降低趋势。土壤pH及容重与土壤有机质呈现显著的负相关关系。亚当斯模型及指数方程能较好地拟合土壤容重及pH对有机质的响应关系，可用于非线性插值法补充土壤容重及pH缺失值。     

羊口疮病毒安徽株116基因的生物信息学分析及原核表达

为了对羊口疮病毒（Orf virus, ORFV）安徽株116基因进行生物信息学分析及原核表达。以ORFVAH-F10株为模板PCR扩增116基因，使用生物信息学软件预测该基因编码蛋白的结构与功能。同时将扩增产物克隆至pET-32a（＋）原核表达载体，经BamH I及EcoR I双酶切鉴定后进行测序，构建pET-32a（＋）-116重组质粒。转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）进行IPTG诱导，纯化蛋白后免疫BALB/c雌性小鼠制备多克隆抗体。测序结果显示，ORFV116基因全长561 bp，编码186个氨基酸。生物信息学分析结果显示：该蛋白分子量约为20.33 kDa，为不稳定亲水性蛋白；无信号肽、保守结构域及跨膜结构域；含有2个N糖基化位点和42个磷酸化位点；二级结构以无规则卷曲为主，分别为延伸链（5.91%）、α-螺旋（14.52%）与无规则卷曲（79.57%）；预测该蛋白含有20个可能的B细胞优势抗原表位与4个CTL细胞表位。SDS-PAGE及Western-blot结果显示，ORFV116蛋白大小约为51 kDa，主要以可溶形式表达且具有良好的反应原性。